Waters專家對HPLC液相色譜的十步優(yōu)化建議

2011-06-19

　固然作為一種簡單的技術(shù)，HPLC仍然存在著可能出錯(cuò)的地方，比如說壓力混亂、管道阻塞、和層析柱不能永遠(yuǎn)使用等題目。以下來自著名科學(xué)儀器設(shè)備制造公司W(wǎng)aters  Corp和LCResources的專家提出的幾點(diǎn)HPLC優(yōu)化建議。
　　
　　1.了解你要用的緩沖液
　　
　　“人們總是為了對相同的處方做出了不同的解釋而給我支付昂貴的咨詢費(fèi)。”
　　
　　--LCResources總裁TomJupille
　　
　　HPLC依靠于分析物之間的微分均衡，固定相(填料),和活動(dòng)相(溶劑)。常規(guī)的活動(dòng)相一般由50%的乙腈加上50%，10mM，pH2.5的磷酸鉀緩沖液組成，至少有四種混合它們的方法：正確法、輕易法、錯(cuò)誤法和笨方法。
　　
　　正確的方法應(yīng)該是：按照正確的比例混合10mM的磷酸和10mM的磷酸二氫鉀達(dá)到pH2.5。然后混與等體積的乙腈混合。這個(gè)過程需要天生標(biāo)準(zhǔn)的操縱流程，明確標(biāo)定緩沖液的配方和有效期等。
　　
　　2.天天更換緩沖液
　　
　　水活動(dòng)相有可能被細(xì)菌，模具和樣品殘留污染，這些污染的出現(xiàn)可能會(huì)升高系統(tǒng)的壓力和進(jìn)步檢測儀的檢測背景，當(dāng)然當(dāng)裝活動(dòng)相的瓶子底部出現(xiàn)混濁的時(shí)候可以很明顯的發(fā)現(xiàn)這些污染，但是當(dāng)這些污染以薄膜的形式存在于瓶底或者瓶壁則不輕易發(fā)現(xiàn)。因此要不天天更換操縱的緩沖液，要不確保層析方法中包含10%-15%的有機(jī)溶劑，減少污染。
　　
　　3.防止分歧格樣品進(jìn)進(jìn)層析柱
　　
　　“盡最大可能使分歧格的樣品闊別層析柱”
　　
　　--FredHutchinsonCancerResearchCenter的蛋白質(zhì)組主管Jupille.PhilipGafken
　　
　　要分離的樣品一定不能對層析柱產(chǎn)生傷害，研究職員在進(jìn)行分離之前需要考慮像：鹽是否會(huì)沉淀?往垢劑是否會(huì)包被或者損害填料等等這樣的題目，而且專家也建議將單純的蛋白沉淀步驟(從血漿中分離分析物的通用方法)轉(zhuǎn)換為固相或者液相提取。比如說，假如你想尋求有機(jī)藥物代謝物，你可以將樣品與有機(jī)溶劑混勻使所想要的化合物進(jìn)進(jìn)溶劑中，而將大量的雜質(zhì)留在水相中。
　　
　　4.使用保護(hù)柱
　　
　　保護(hù)柱或者預(yù)柱是指置于主分析柱前的一根短(0.5-2cm)，相對便宜的柱子?；ù蟾?0到400元購置這樣一根保護(hù)柱可以明顯地延長昂貴的分析柱的壽命。有研究職員在正常的環(huán)境下進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一根柱子可以進(jìn)行1，000-2，000次填注，而安置了保護(hù)柱之后，柱子可以進(jìn)行10，000次的填注之后仍未出現(xiàn)稍微的改變。而且保護(hù)柱的填料也應(yīng)該周期性的改變，大約每200-500次填注后更換一次--假如樣品較臟則應(yīng)該更頻繁更換。
　　
　　5，不要讓填料保存在水緩沖液中
　　
　　在包含活動(dòng)相的緩沖液還殘留在系統(tǒng)中的時(shí)候切勿封閉HPLC系統(tǒng)。這是由于溶劑可以蒸發(fā)，留下緩沖液結(jié)晶，終極導(dǎo)致內(nèi)部損傷填料，由此引起一些小毛病。專家們以為用不含溶劑的緩沖液沖洗HPLC系統(tǒng)或者從不封閉HPLC系統(tǒng)，這樣在其它條件一致的情況下可以延長柱子壽命，另外把柱子放進(jìn)運(yùn)載溶劑(shippingsolvent)中保存(例如純乙腈)也可以延長層析柱壽命--由于運(yùn)載溶劑對柱料的損傷最小。

　6.確定“四周環(huán)境”是指什么
　　
　　很多HPLC方法要求適合的環(huán)境溫度(ambienttemperature)，但總會(huì)碰到這樣的題目：這

里的室溫指的是仲春的蒙特利爾還是七月的波多黎各呢?也就是說，實(shí)際上HPLC的工作溫度可以是為所欲為的-4°C到25°C之間的任意溫度。到底什么是合適的周遭環(huán)境，我們必須根據(jù)具體的情況來確定，這是由于色譜法依靠于分析物在固定相和活動(dòng)相之間的平衡進(jìn)行分離，而平衡當(dāng)然依靠于溫度，所以當(dāng)你改變溫度，平衡分布也會(huì)改變，保存時(shí)間改變，可能出現(xiàn)誤識(shí)別樣品峰。
　　
　　7.天天檢查系統(tǒng)的壓力
　　
　　固然正確值依靠于你所使用的方法，但條件是系統(tǒng)的壓力不能明顯的高于或者低于前一天的壓力，或者說不能不穩(wěn)定，比如2，000±10psi可能很不錯(cuò)，而1,500±700psi則不適合。研究職員需要經(jīng)常記錄壓力，當(dāng)然很多現(xiàn)代的HPLC系統(tǒng)具有記錄泵壓力數(shù)據(jù)的特性，這些數(shù)據(jù)在維修中起到不可估量的作用。比如說假如說有一天你忽然在一系列的運(yùn)轉(zhuǎn)中得到很多陰性結(jié)果。有可能是所想要的樣品峰偏離了它所對應(yīng)的保存時(shí)間區(qū)(retentiontime)，這個(gè)時(shí)候你要做的首要事情就是檢查泵壓力的記錄
　　
　　8.不要在檢查接頭方面省事
　　
　　不要忽略泄漏。隨著時(shí)間的積累這對于實(shí)驗(yàn)的影響更大，不僅僅是不方便的題目，滲漏使得保存時(shí)間的偏移，導(dǎo)致所想要的樣品峰延遲出現(xiàn)。專家的建議是：至少會(huì)將能見到的接頭都掃視一遍。假如你發(fā)現(xiàn)了滲漏現(xiàn)象，切斷接頭并替換。
　　
　　9.一次只能更換一樣?xùn)|西
　　
　　當(dāng)東西出現(xiàn)題目的時(shí)候，切忌一次性換完所有東西。在維修中，應(yīng)該從系統(tǒng)整體出發(fā)，因此不能一次更換預(yù)柱，溶劑，和檢測燈，而應(yīng)該每次只更換一樣?xùn)|西。
　　
　　10.天天檢測
　　
　　在你不知道HPLC的日常運(yùn)轉(zhuǎn)情況下，你不可能對它進(jìn)行維修，所以專家建議天天對HPLC進(jìn)行檢測，收集相關(guān)的數(shù)據(jù)。